Section 1
1. 前言——生物修复中的限速因子与供氧
作为石油污染土壤和地下水的净化方法，生物修复作为低成本、可持续、环境友好的途径而受到关注。
在石油的生物修复中，存在适当的微生物并使其与分解对象物质（油）接触是最低条件，此外，微生物还需要溶于水的氧和营养（氮、磷、钾）（图-1）。
油的分解是氧化分解，宜在好氧环境下进行，需要营造环境使供氧不成为限速因子。
（理论上，例如微生物分解1kg油类之一的苯所需的氧量约为3kg。）
因此，为提高微生物活性，我们着眼于“供氧”，通过室内试验研究了缓释氧剂和生物催化剂能否活化微生物。
【缓释氧剂】
缓释氧剂有镁系、钙系等，均需注意其pH呈碱性。本试验使用的缓释氧剂由过氧化钙、氢氧化钙、二水硫酸钙组成，过氧化钙含量约30％，为非危险品。
【生物催化剂】
由天然有机物精制而成的富氧水，能够提高微生物活性。生物催化剂既不从水中释放氧，也不从水面吸收氧。通过催化作用从水分子中分离出氧原子，同时氧被微生物的细胞表面吸收。生物催化剂中的氧不是游离态，因此无法作为溶解氧测定。
Section 2
2. 室内试验概要
所用缓释氧剂为钙系，是碱性材料。pH是影响微生物的因素，极端的酸性或碱性会超出微生物的最适范围。因此，事先考察了添加缓释氧剂引起的pH和溶解氧量的变化（以下称事前试验）。
根据其结果确定缓释氧剂的用量，并进行了以柴油为对象的微生物培养试验（以下称培养试验）。
培养试验中测定了pH、溶解氧量、微生物总数，最后观察了油膜。微生物的活化根据微生物总数的结果和油膜的状态进行评价。
【事前试验的试验方法】
- 向1L玻璃烧杯中加入自来水1L，静置5分钟后测定pH、溶解氧量。
- 向①中加入必需元素水溶液（10倍稀释液）5ml、营养剂2.0g、复合生物制剂“TerraZyme”（以下称TerraZyme）2.0g，轻轻搅拌并静置5分钟后测定pH、溶解氧量。
- 向②中加入缓释氧剂5g，轻轻搅拌并静置5分钟后测定pH、溶解氧量。
- 重复③直至pH超过0。
【培养试验的试验方法】
试验系列及材料用量见表-1。
表-1
| 试验系列 | 材料 | |||||
| 水 | 柴油 | 缓释氧剂 | 复合生物制剂 TerraZyme | 营养剂 (N・P・K) | 必需元素水溶液 (10倍稀释液) | |
| ①空白 | 自来水400mL | 0.4g | 未添加 | 0.8g | 0.8g | 0.2mL |
| ②催化剂 | 催化剂400mL | 0.4g | 未添加 | 0.8g | 0.8g | 0.2mL |
| ③缓释氧剂1.5g/L | 自来水400mL | 0.4g | 0.6g | 0.8g | 0.8g | 0.2mL |
| ④缓释氧剂3.0g/L | 自来水400mL | 0.4g | 1.2g | 0.8g | 0.8g | 0.2mL |
- 向500ml玻璃烧杯中放入TerraZyme，滴入柴油，用药匙混合使其充分浸润。
- 根据试验方案加入自来水或催化剂，使浸有油的TerraZyme悬浮。
- 加入必需元素水溶液、营养剂、缓释氧剂，在磁力搅拌器搅拌下采集初始值试样，用于微生物总数的测定。
- 停止③的磁力搅拌并静置5分钟后，测定pH、溶解氧量。
- ④测定后，用保鲜膜封住烧杯，开始搅拌养护。
- 1天后、3天后、5天后按④、⑤的步骤同样进行试样采集和测定。
Section 3
3. 试验结果
3-1. 事前试验的结果
如图-2、3所示，向1L自来水中加入3.0g缓释氧剂时pH超过了9.0。因此，培养试验使用的缓释氧剂设定为3.0g/L及其一半1.5g/L两个系列。
3-2. 培养试验的结果
pH和溶解氧量的测定结果见表-2。
添加了缓释氧剂的系列③、④，随着试验天数的增加pH上升。添加3.0g/L的系列④在5天后pH超过了10.0。溶解氧量方面，添加了缓释氧剂的系列③、④虽高于系列①、②，但其量未达到2倍。
表-2
| 系列 | 项目 | 添加材料后即时 | 1天后 | 3天后 | 5天后 |
|---|---|---|---|---|---|
| ①空白 | pH | 6.31 | 6.62 | 6.72 | 6.34 |
| 溶解氧量(mg/L) | 4.87 | 4.39 | 5.36 | 5.23 | |
| ②催化剂 | pH | 6.40 | 7.10 | 7.13 | 6.70 |
| 溶解氧量(mg/L) | 7.63 | 8.87 | 9.02 | 8.94 | |
| ③缓释氧剂1.5g/L | pH | 5.56 | 4.10 | 7.78 | 5.30 |
| 溶解氧量(mg/L) | 5.89 | 4.29 | 7.78 | 5.30 | |
| ④缓释氧剂3.0g/L | pH | 8.25 | 9.51 | 9.83 | 10.09 |
| 溶解氧量(mg/L) | 6.44 | 5.09 | 5.90 | 5.70 |
微生物总数的测定结果见表-3、图-4。微生物增殖最显著的是用催化剂而非自来水培养的系列②：1天后增至约8.8倍，3天后增至近100倍，与使用自来水的系列①相比，微生物的增殖速度快10倍。系列②的微生物增殖在3天后趋于缓慢，我们认为这是因为柴油已被分解。
另一方面，添加了缓释氧剂的系列③、④未见微生物增殖，反而逐渐减少。系列③在5天后对原液0.1ml进行n=3测定，未观察到1个细胞，故记为0 cells/ml。
表-3
| 系列 | 添加材料后即时 | 1天后 | 3天后 | 5天后 |
|---|---|---|---|---|
| ①空白 | 1.01E+06 | 1.39E+06 | 1.02E+07 | 2.39E+08 |
| ②催化剂 | 1.31E+06 | 1.16E+07 | 1.19E+08 | 2.43E+08 |
| ③缓释氧剂1.5g/L | 6.25E+05 | 2.56E+05 | 2.72E+05 | 0.00E+00 |
| ④缓释氧剂3.0g/L | 6.41E+05 | 1.60E+05 | 2.88E+05 | 3.21E+04 |
(单位：cells/ml)
5天后各项目测定完毕后，观察了烧杯内水面的油膜（系列①～④）。
系列①：空白组可见点状油膜。
系列②：催化剂组无油膜，水澄清。
系列③：整个水面被油覆盖。
系列④：整个水面被油覆盖。
Section 4
4. 讨论
由培养试验结果可知，无论从微生物总数的结果，还是从油被迅速分解、油膜消失的结果来看，微生物活性最高的都是系列②的催化剂。系列②的溶解氧量在试验开始后低于其他系列，我们认为这是因为微生物总数多于其他系列，溶解氧消耗较多。
承担供给溶解氧作用的缓释氧剂，随着添加量增加pH上升，超出微生物的最适范围，因此考虑pH的话，无法确保相对其他系列具有压倒性优势的溶解氧量。添加了缓释氧剂的两个系列微生物数显著减少，其原因可能是pH的影响、缓释氧剂中所含二水硫酸钙的影响等，但本试验尚未查明原因。
系列①的空白组与系列②相比，微生物增殖和油的分解虽需要更长时间，但可以说具有充分的微生物活性。
Section 5
5. 结语
在石油的生物修复中，提高微生物活性有助于提高净化的速度和确定性。本次室内试验的结果表明，作为提高微生物活性的一种方法，生物催化剂是有效的。生物催化剂营造有助于微生物增殖的环境，防止微生物增加导致的氧枯竭，也不会引起pH的大幅变化。
石油的生物修复是低成本、环境友好的净化工法。日本本来就没有针对油的管制，但现实是，即便只是为了消除油味和油膜，也因担心工期而采用开挖清除、石灰混合等环境负荷高、成本高的工法。若使用生物催化剂的生物修复能够对这一现实投下一石，或许就能看到摆脱环境落后国的道路。