水性生物に対する影響試験

複合バイオ製剤「オッペンハイマー・フォーミュラ」の安全性を確認するため、水生生物に対する影響試験を実施しました。

• デバスズメダイの生存に及ぼす影響(7日間の短期飼育試験：急性毒性試験）*1)

  実施機関：ナホトカ号海洋油汚染バイオレメディエーション研究会

  各区10尾のデバスズメダイ（平均体長約3cm、体重約1g）を20リットルの人工海水中で7日間、28℃、一日当たり給餌3回（朝、昼、晩）で飼育観察した。 試験区の飼育水には当該微生物製剤を濃度0.1%になるように添加した。（微生物製剤の添加試験）

  	死亡数（尾）	生存数（尾）	生存率（％）
  対照区	0	20	100
  試験区	0	20	100

  飼育試験の結果より、デバスズメダイに対する急性毒性は認められなかった。

• ニジマスの生存に及ぼす影響(4日間の短期飼育試験：急性毒性試験）*2)

  実施機関：カナダ環境省

  ニジマス（平均体長約30mm、体重約0.25g）を10リットルの脱塩素した水道水中において、4日間15℃で飼育した。
  試験区の飼育水には当該微生物製剤を濃度0.1%（10,000 mg/L）になるように添加した。（微生物製剤の添加試験）。 飼育試験の結果より、当該微生物のLC50*3） は>10,000 mg/Lであった。これより、当該微生物のニジマスに対する急性毒性は認められなかった。
  
  参考：界面活性剤（LAS直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；一般的に使用されている界面活性剤）のニジマスに対するLC50＝4.7mg/L。

• アユ稚魚の生存に及ぼす影響(7日間の短期飼育試験：急性毒性試験)*1

  実施機関：ナホトカ号海洋油汚染バイオレメディエーション研究会

  各区20尾のアユの稚魚（平均体長約8cm、体重約5g）を100リットルの淡水（地下水）中で7日間、19～20℃、一日当たり給餌3回（朝、昼、晩）で飼育観察した。
  試験区の餌には当該微生物製剤を濃度0.1%になるように添加した。（微生物製剤の投与試験）

  	死亡数（尾）	生存数（尾）	生存率（％）
  対照区	0	20	100
  試験区	0	20	100

  飼育試験の結果より、アユの稚魚に対する急性毒性は認められなかった。

• アユ稚魚の生存に及ぼす影響(30日の長期飼育試験：亜急性毒性試験）*1)

  実施機関：ナホトカ号海洋油汚染バイオレメディエーション研究会

  各区20尾のアユの稚魚（平均体長約8cm、体重約5g）を80リットルの淡水（地下水）中で30日間、19～20℃、一日当たり給餌3回（朝、昼、晩）で飼育観察した。
  試験区の餌には当該微生物製剤を濃度0.1%になるように添加した。（微生物製剤の投与試験）

  	死亡数（尾）	生存数（尾）	生存率（％）
  対照区	5	15	75
  試験区	4	16	80

  飼育試験の結果より、対照、試験の両区にアユの死亡が認められたが、死亡数は試験区で少なく、死亡したアユの解剖結果からも異常はまったく認められなかった。アユの死亡が試験開始後の一週間に集中したので、死亡原因は飼育環境の変化によるショック死ではないかと考えられる。従って、アユの稚魚に対する当該微生物製剤の亜急性毒性は認められないと判定される。

• ミジンコの生存に及ぼす影響(2日間の短期飼育試験：急性毒性試験）*2)

  実施機関：カナダ環境省

  ミジンコを200ミリリットルの脱塩素した水道水中において、2日間20℃で飼育した。
  試験区の飼育水には当該微生物製剤を濃度0.1%（10,000 mg/L）になるように添加した。（微生物製剤の添加試験）。 飼育試験の結果より、当該微生物のLC50*3） は>10,000 mg/Lであった。これより、当該微生物のミジンコに対する急性毒性は認められなかった。

• ウニ（Toxopneusts pileolus）の発生試験

  実施機関：ナホトカ号海洋油汚染バイオレメディエーション研究会

  当該微生物製剤の生物への影響を確認するために、ウニ卵（ラッパウニ、Toxopneusts pileolus）の受精実験を行った。こうした受精実験は、カナダ環境省およびアメリカ環境保護庁において、海水の生物検定法に用いられている。
  また、比較のため油処理剤および家庭用中性洗剤を用いた実験を行った。 微生物製剤、油処理剤および家庭用中性洗剤を海水に添加し、0ppm（コントロール）、1ppm、5ppm、10ppm、50ppm、100ppmとした。これら溶液中において受精実験を行い、顕微鏡下で卵100個の受精膜形成を観察、計測し、4回反復した平均値をウニ卵の受精率データとした。

  濃度（ppm）	コントロール	当該微生物製剤	油処理剤	家庭用中性洗剤
  0	95％
  1		96％	78％	82％
  5		92％	61％	20％
  10		92％	41％	6％
  50		80％	13%	1％
  100		68％	4％	0％

  実験の結果、微生物製剤、油処理剤、家庭用中性洗剤とも、海水中の濃度が高くなるに従い、ウニ卵の受精率は低下した。しかし、影響の程度は大きく異なり、100ppmの受精率は、油処理剤4%、家庭用中性洗剤0%と受精を著しく阻害するのに対し、微生物製剤は68%と影響が小さかった。従って、油処理剤、家庭用中性洗剤と比較すると、当該微生物製剤の影響は小さいと判定される。

  引用；Bioremediation on the shore after an oil spill from the Nakhodka in the Sea of Japan, II. Toxicity of a bioremediation agent with microbiological cultures in aquatic organisms, Marine Pollution Bulletin 40 308-324(2000)

• アミ、トウゴロイワシに対する急性毒性試験

  実施機関：アメリカ合衆国環境保護庁

  メキシコ湾メガボルグ号油流出事故において、オッペンハイマーフォーミュラを使用したバイオレメディエーションによる浄化処理を行った。この現場試料水を用いて、当該微生物製剤のアミ（Misidopsis bahia）およびトウゴロイワシ(amenidia beryllina)に対する毒性試験を行った。
  コントロール、バイオレメディエーション処理前、バイオレメディエーション処理後の3つの試料水に、当該微生物製剤の濃度を変えて添加し、アミおよびトウゴロイワシの飼育試験を行なった。
  その結果、96時間の飼育実験において、いずれの系、いずれの微生物製剤添加濃度においても、アミ、トウゴロイワシのLC50は計測されなかった。本実験で、アミおよびトウゴロイワシの若干の死亡が見られたが、添加微生物濃度との相関は認められなかった。また、コントロール区のアミ、トウゴロイワシの生存状況はきわめて良好であり、実験に供した生物が試験に適した状態にあったことが確認された。
  以上のことより、当該微生物製剤のアミ、およびトウゴロイワシに対する毒性は認められなかった。

  引用；アメリカ合衆国環境保護庁、環境調査研究所（1990年7月）

• ワムシ（Brachionus plicatilis）に対する影響評価

  実施機関：テキサス大学海洋研究所

  テスト生物としてワムシ（Brachionus plicatilis）を使用し、米テキサス大学海洋研究所にて、当該微生物（以下フォーミュラ）のワムシに対する影響を試験した。

  試験方法

  （１）無菌系（他の微生物がいない状態）での試験

  ワムシを0.5％の次亜塩素酸ソーダに3分間浸し、滅菌処理を施した後、滅菌食塩水で培養して、無菌ワムシを調整した。このワムシを無菌海水に接種し（最終濃度5匹/ml）、これにフォーミュラ（最終濃度0.01mg/ml）を添加した。コントロールとして、非滅菌海水に無菌ワムシ（最終濃度5匹/ml）を接種したものを用意した。 フォーミュラ添加、コントロールともにそれぞれ4連で試験を行なった。4日間の培養を行ない、ワムシの増加量（P）と増殖速度（GR）について、フォーミュラ添加とコントロールとの比較を行なった。 PおよびGRは以下の計算式で算出し、添加区・コントロール区両者の有意差の検定を統計プログラム（ANOVA）を用いて行なった。 P =（最終濃度－初期濃度）/培養日数（4日間） GR =（ln最終濃度－ln初期濃度）/培養日数（4日間）

  （２）開放系（他の微生物がいる状態）での試験

  フィルター濾過（孔径1.2μm）した海水に、ワムシを接種し、フォーミュラ（最終濃度0.01mg/ml）を添加した。同時にコントロール（フォーミュラ無添加）を用意し、それぞれを4日間培養した後、無菌系の試験と同様に、両者のワムシの増加量（P）、および増殖速度（GR）を比較した。試験は2連で行ない、それぞれのワムシ初期濃度は30匹/mlと17匹/mlであった。

  試験方法

  無菌系および開放系のいずれの試験においても、ワムシの増殖量および増殖速度について、フォーミュラ添加区とコントロール区の間に有意な差は認められなかった。 従って、ワムシの増殖に対するフォーミュラの影響はないと判断された。

• 藻類（Skeletonema costatum）に対する増殖阻害試験

  実施機関：環境庁企画調整局環境研究技術課

  当該微生物製剤の藻類（Skeletonema costatum）に対する増殖阻害試験を次の要領で行った。

  試験方法

  海水に原油を添加（原油：海水＝1：9）した各試験区に、微生物製剤を各濃度設定になるように添加し（ただし、海水区および含油対象区を除く）、これに藻類を初期濃度10,000～20,000細胞/mlになるように接種し7日間の培養を行った。以下に藻類の増殖曲線を示す。

   

  

  藻類の増殖曲線（クロロフィルa）

  海水区は標準の藻類増殖曲線を示していることから、試験で用いた藻類に問題がないことが証明された。含油対象区と製剤添加区における藻類の増殖曲線には顕著な差が認められなかった。

  結果

  本剤は油（原油）に剤が加わった場合の毒性が、油だけの場合に比べて同等以下であることが証明された。溶解限界の最大濃度においても珪藻の増殖阻害は見られず、毒性指標となるEC50値は測定限界以上であった。

  環境庁企画調整局環境研究技術課：海岸の流出油バイオレメディエーション利用指針検討（海岸の油汚染に対するバイオレメディエーション利用指針作成検討会、生物を利用した環境修復等の安全性評価手法等検討調査、及び流出油処理に対するバイオレメディエーション適用に関するケーススタディ等検討調査）〈平成10～12年度〉で実施。

*1）引用； Bioremediation on the shore after an oil spill from the Nakhodka in the Sea of Japan, II. Toxicity of a bioremediation agent with microbiological cultures in aquatic organisms, Marine Pollution Bulletin 40 308-324 (2000)
*2）試験機関；BEAK CONSULTANTS LIMITED (Canada,1993)
*3）LC50； Madian Lethal Concentration（半数致死濃度）
試験生物の50％を死亡させたと推定される濃度。水生生物に対する急性毒性の程度を示す指標で、値が低いほど高い毒性を表す。